A técnica RNA-Seq pode ser utilizada para medir os níveis de expressão gênica e identificar genes diferencialmente expressos entre amostras de indivíduos saudáveis e doentes.

A investigação de diferentes isoformas de proteínas não pode ser realizada pela técnica de RNA-seq, visto que tal metodologia não permite a detecção de RNAs gerados por splicing alternativo.

O sequenciamento de transcriptoma permite a identificação de transcritos de RNA mensageiro, porém não é capaz de analisar transcritos de RNA ribossômico e RNA transportador.

Ambas as técnicas de RNA-Seq e RT-PCR permitem a identificação e a quantificação de transcritos sendo que o uso da técnica de RT-PCR fornece uma visão mais abrangente da expressão gênica comparativamente com RNA-seq.

Transcritos longos de RNAs Não Codificantes (lncRNAs), recentemente descobertos, não podem ser identificados pela técnica de RNA-Seq por representarem RNAs não codificantes.