Deve ser realizado até o 12º dia de vida.

Em crianças prematuras (idade gestacional < 37 semanas), a realização do teste do pezinho deve ser feita após a primeira semana de vida, e o teste deve ser repetido quando o recém-nascido completar 1 mês.

Escolher o local de coleta, sendo o mais indicado a borda interna ou externa do calcanhar.

Não tocar nos círculos do papel de filtro antes ou após a coleta para evitar contaminação da amostra ou interferência na camada de papel.

Esperar o álcool da antissepsia secar antes de iniciar a coleta, a fim de evitar que a amostra fique mal colhida.