Discos de papel filtro são impregnados com concentrações-padrão do antimicrobiano, colocados em placa de ágar Mueller-Hinton previamente semeada com uma suspensão padronizada do microrganismo em teste.

Após 18 a 24h de incubação, mede-se o halo de inibição e, de acordo com critérios estabelecidos, o antibiótico será classificado como: sensível, intermediário ou resistente.

A aplicação dos discos, na placa, deve ser realizada imediatamente após a inoculação, sendo a distância entre os discos de no mínimo 5 mm; se necessário, o disco pode ser removido rapidamente, para um melhor posicionamento.

A suspensão bacteriana-padrão utilizada para o teste deve ser obtida em uma concentração equivalente a 0,5 da escala de McFarland, que corresponde a aproximadamente 15 x 108 UFC/mL. Etapa crítica para obtenção de resultados confiáveis.