No PCR dois oligonucleotídeos sintéticos são preparados, complementares às sequências em fitas opostas ao DNA- alvo, em posições que definem as extremidades do segmento a ser amplificado. Os oligonucleotídeos servem como iniciadores de replicação que podem ser estendidos por uma DNA-polimerase. As extremidades 3’ dos iniciadores hibridizados são orientadas uma para a outra e posicionadas para a síntese do DNA pelo segmento de DNA.

O procedimento de PCR baseia-se em DNA-polimerases que sintetizam fitas de DNA a partir de desoxirribonucleotídeos, utilizando um molde de DNA. Todas as DNA-polimerases sintetizam DNA na direção 5’ à 3’. Além disso, as DNA- polimerases não sintetizam DNA novo, mas, ao contrário, devem adicionar nucleotídeos a fitas preexistentes, denominadas oligonucleotídeos iniciadores (primers).

A PCR básica necessita de três componentes: uma amostra de DNA contendo o segmento a ser amplificado, o par de oligonucleotídeos iniciadores sintéticos e o DNA-polimerase. A mistura de reação é aquecida brevemente para desnaturar o DNA, separando as duas fitas. A mistura é resfriada de modo a que os oligonucleotídeos iniciadores possam renaturar com o DNA.

A baixa concentração de oligonucleotídeos iniciadores aumenta a probabilidade de renaturação com cada fita do DNA desnaturado antes que as duas fitas de DNA (presentes em concentração muito menor) possam renaturar entre si. O segmento é, em seguida, replicado seletivamente pela DNA-polimerase. A PCR utiliza uma DNA-polimerase termoestável, que se mantém ativa após cada etapa de aquecimento e não precisa ser reabastecida.