É considerado dogma da biologia molecular que a informação genética contida no DNA é transcrita em RNA e este traduz uma mensagem que é expressa na forma de proteínas. A Engenharia Genética constitui um conjunto de técnicas de análises moleculares que permitem estudos de caracterização, expressão e modificações do material genético (DNA e RNA) dos seres vivos. Assim, uma das principais ferramentas técnicas da Engenharia Genética é a extração de ácidos nucléicos. Assinale a alternativa que corresponda corretamente à ordem das etapas básicas a ser seguidas nos protocolos de extração do DNA das células vivas:

I. Ruptura da parede celular (células vegetais) e membrana plasmática (todas as células) - Nos tecidos vegetais inicia-se por meio de maceração do tecido congelado em gral & pistilo. A ruptura da membrana plasmática é feita com a utilização de detergentes como o SDS e o CTAB;

II. Precipitação do DNA em solução aquosa com agentes desidratantes (sais e álcoois) - Nessa fase, geralmente, são utilizados álcoois e os mais frequentes são o isopropanol e o etanol na presença de sal. Os sais realizam um efeito precipitante do tipo salting out parecido com aquele que ocorre com soluções de proteínas. Os principais são: o cloreto de sódio, o acetato de sódio e o cloreto de amônio;

III. Extração de proteínas - Com a ruptura da membrana plasmática, saem para o meio extracelular todos os componentes intracelulares como DNA, RNA, proteínas, polissacarídeos e organelas. As organelas e os restos celulares (membranas, debris) são eliminados por meio de centrifugação em velocidades de 16.000 X g. Como são mais pesadas, tendem a se precipitar enquanto as moléculas de DNA, RNA e proteínas permanecem no sobrenadante. As proteínas são removidas por agentes tais como o fenol, o clorofórmio e o álcool isoamílico. Esses agentes desnaturam as proteínas que tendem, também, a precipitar em soluções aquosas. Em seguida, as amostras são novamente submetidas à centrifugação;

IV. Degradação do RNA residual - O RNA restante nas amostras de DNA genômico pode ser eliminado pela ação de ribonucleases (RNAses) que o degradam. A presença de RNA nas amostras interfere em sua quantificação espectrofotométrica, bem como no processo de amplificação gerando fragmentos amplificados inespecíficos;