Para o preparo desse meio, pode-se utilizar sangue humano ou de animal. Se utilizado sangue de carneiro ou coelho, deve-se adicionar os suplementos à base de NAD (coenzima I) e cisteína após resfriar a base achocolatada a aproximadamente 25 °C.

Nesse meio, o crescimento de microrganismos exigentes como Haemophilus spp. e Neisseria spp. é limitado, sendo necessários outros meios, como ágar sangue, quando há esse tipo de suspeita clínica.

Devem ser adicionados 50 mL de sangue desfibrinado de humano ou animal para cada 100 mL de base. Após, deve-se homogeneizar bem até lisar totalmente as hemácias, e o meio apresentar uma cor castanho-escuro.

À base do meio, é adicionado sangue de cavalo, carneiro ou coelho em temperatura alta, o que faz com que as hemácias lisem, liberando hemina e hematina, compostos fundamentais para o crescimento dos microrganismos exigentes.

Quando adicionados sais de bile nesse meio, é possível inibir o crescimento de microrganismos Gram-positivos.