A aplicação excessiva do solvente orgânico descorante promove a precipitação do cristal violeta, intensificando a tonalidade purpúrea nos espécimes que possuem peptideoglicano delgado.

A contracoloração pela safranina exerce um papel competitivo e de afinidade superior, deslocando e substituindo quimicamente o complexo do corante primário das células não descoradas.

As bactérias Gram-positivas tendem a reter o complexo cristal violeta-lugol após a etapa de descoramento em razão das características estruturais de sua parede celular.

As bactérias Gram-negativas mantêm o complexo cristal violeta-lugol adsorvido à membrana externa devido à natureza anfipática e hidrofóbica dos lipopolissacarídeos (LPS).

O lugol atua formando uma ligação covalente irreversível com as proteínas da parede celular, impedindo a eluição do corante primário em bactérias Gram-negativas antes do descoramento.