A parede das bactérias gram-negativas apresentam grande quantidade de lipídios, o que aumenta a permeabilidade aos solventes orgânicos, permitindo a descoloração.

Devido à maior concentração do heteropolimero do tipo peptideoglicano, a parede das bactérias gram-negativas e mais susceptível à desestruturação, quando comparada com a parede das bactérias gram-positivas.

No exame microscópico, as bactérias gram-positivas são aquelas que retêm o corante cristal violeta, devido à diminuição na quantidade de ácido teicoíco. Há o aumento da permeabilidade da parede celular aos solventes orgânicos, por conterem mais lipídios.

A coloração de gram se inicia com a aplicação de álcool; em seguida, há a aplicação do corante de cristal de violeta e da solução de iodo. As bactérias gram negativas são totalmente coradas de azul e as bactérias gram positivas ficam descoradas. A etapa final é a aplicação do corante safranina, para que essas últimas adquiram coloração rosa.

As bactérias álcool-ácido resistentes são as que retem azul de metileno, quando descoradas.