O esfregaço, antes de ser submetido a coloração, deverá estar seco (exposto ao ar), sendo fixado com calor acima de 200 ºC.

Para a fixação do esfregaço utiliza-se o formol a 50%.

A sequência para coloração de Gram é: cristal violeta, lugol, formol, fucsina e metanol.

As bactérias Gram-positivas retêm o cristal-violeta e se apresentam com coloração esverdeada ou azulada enquanto as Gram-negativas são descoradas pela solução de formol com metanol e se apresentam transparentes.

A coloração de Gram é usada para classificar bactérias com base no tamanho, morfologia celular e comportamento diante dos corantes.