Anticorpos policlonais podem ser mais sensíveis, mas menos específicos que anticorpos monoclonais, o que se explica pelo fato de os anticorpos policlonais poderem reconhecer diferentes locais de ligação em uma única proteína, enquanto os monoclonais reconhecem apenas um único local de ligação.

O grau de susceptibilidade de uma enzima à desnaturação e à inativação varia durante o processo de fixação, sendo a peroxidase preservada somente em secções teciduais parafinadas.

O bloqueio da peroxidase endógena pode ser executado depois da adição do reagente secundário marcado com a enzima.

O bloqueio da atividade de peroxidase endógena primariamente produz resultados satisfatórios ao combinar soluções de H₂O₂ (peróxido de hidrogênio) e metanol.

Azida sódica a 0.1% misturada com H₂O₂ também pode ser uma técnica efetiva no bloqueio da peroxidase endógena.

No método peroxidase-antiperoxidase (PAP), o anticorpo primário e o anticorpo terciário devem ser da mesma espécie animal. O anticorpo secundário deverá se ligar especificamente às porções FC dos anticorpos primário e terciário e, necessita, portanto, ser produzido em espécie animal diferente, e, nesse caso, o anticorpo primário poderia ser produzido a partir de um coelho, o secundário, a partir de uma cabra, e o terciário (do reagente PAP) a partirdo coelho e contra a molécula de peroxidase (horseradish).

O sistema de detecção, com base no método indireto do complexo avidina-biotina-peroxidase (ABC), consiste em adicionar um anticorpo primário, seguido de um anticorpo secundário biotinilado e, finalmente, adicionar o complexo peroxidase-avidina-biotina.

Quanto menor o tempo de fixação menor a formação de ligações cruzadas e, por isso, é preferível um menor tempo de fixação para o emprego de métodos imuno-histoquímicos, razão pela qual a fase pré-analítica é muito importante nesses métodos.

Enzimas, como tripsina e pepsina, constituem um método enzimático para recuperação antigênica.

O controle negativo da reação imuno-histoquímica pode ser realizado omitindo-se o anticorpo primário nas lâminas testadas.